Pandemia z 2019 r. spowodowana nowym koronawirusem (SARS-CoV-2) nadal szybko rozprzestrzenia się na całym świecie. Amplifikacja kwasu nukleinowego służy jako złoty standard metody potwierdzania zakażenia COVID-19. Jednak wyzwania stojące przed laboratoriami diagnostycznymi z krajów nierozwiniętych obejmują brak zestawów i materiałów do oczyszczania wirusowego RNA. Dlatego pilnie należy zweryfikować alternatywne metody izolacji kwasów nukleinowych dla SARS-CoV-2.
Nasze wyniki pokazują, że stężony bufor do amplifikacji lizy wirusa (vLAB) przygotowany z niejonowym detergentem IGEPAL umożliwia jakościowe wykrywanie SARS-CoV-2 przez bezpośrednią reakcję łańcuchową odwrotnej transkryptazy-polimerazy (dRT-PCR). Ponadto vLAB skutecznie inaktywował SARS-CoV-2. Ponieważ metoda ta jest niedroga i nie jest wymagany sprzęt do oczyszczania RNA ani dodatkowa synteza cDNA, to dRT-PCR z vLAB należy rozważyć jako alternatywną metodę jakościowego wykrywania SARS-CoV-2.
Liza komórek, a następnie uwolnienie genomowego DNA to ciągły dylemat technik biologii molekularnej.
W większości przypadków technologie takie jak PCR i inne techniki amplifikacji wymagają etapów ekstrakcji i oczyszczania DNA. Proces inteligentnej amplifikacji w wersji 2 (SmartAmp2) to izotermiczna i zintegrowana technologia amplifikacji, która eliminuje potrzebę czasochłonnego przygotowywania próbek w celu szybkiego wykrywania kwasów nukleinowych, w tym polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP), mutacji i innych celów. Ponadto amplifikacja DNA bezpośrednio z pełnej krwi jest korzystna i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego. Tradycyjne testy SmartAmp2 obejmują dwa etapy i wymagają wstępnej obróbki alkalicznej w temperaturze 98 stopni C przed przebiegiem w temperaturze 60 stopni.
Aby uczynić SmartAmp2 prawdziwie izotermicznym i uprościć amplifikację DNA, niniejszym wprowadzamy SmartAmp Isothermal Lysis Buffer (SIL-B), nowo opracowany chaotropowy bufor do lizy, który umożliwia jednoczesne odzyskiwanie i denaturację materiału genomowego bezpośrednio z pełnej krwi w jednolitych 60 stopniach C. Udoskonalona metoda izolowania kwasów nukleinowych z krwi pełnej jest kamieniem milowym w tworzeniu prawdziwie izotermicznego wzmacniacza SmartAmp2 od początku do końca w jednej temperaturze, zwiększając jego potencjał do rutynowego stosowania w terenowych testach przyłóżkowych. Ponadto wstępne traktowanie SIL-B umożliwia amplifikację PCR materiału genomowego bezpośrednio z pełnej krwi.
Wykrywanie wirusów na jagodach jest trudnym zadaniem, często utrudnionym przez obecność substancji hamujących RT-qPCR z soku z jagód.
Wcześniej opublikowano metodę bezpośredniej ekstrakcji do wykrywania wirusów (mysiego norowirusa i faga GA) z mrożonych malin. Rozbudowaliśmy (różne rodzaje jagód i wirusów) i ulepszyliśmy metodę za pomocą kolumn MobiSpin S400, które filtrują kwasy nukleinowe w oparciu o chromatografię wykluczenia. Chociaż w przefiltrowanym RNA nie wykryto hamowania, niefiltrowany RNA wymagał rozcieńczenia od 1:2 do ponad 1:8 w celu usunięcia hamowania. Zmodyfikowana metoda dała odzyskanie norowirusa bydła około 40,8 ± 4,5% (40,0 ± 7,0%), 48,0 ± 26,0% (50,5 ± 7,8%), 28,3 ± 2,6% (45,8 ± 6,6%) z mrożonych (świeżych) malin, truskawek i odpowiednio jagody. W przypadku tych samych próbek odzyski wirusa zapalenia wątroby typu A wynosiły 34,0 ± 5,9% (34,0 ± 6,0%), 40,0 ± 13,3% (34,2 ± 10,5%) i 23,0 ± 6,8% (31,5 ± 7,9%).
W przypadku adenowirusa 40 (wirus DNA) odzyski wynosiły odpowiednio 21,2 ± 8,6%, 16,0 ± 3,2% i 5,7 ± 0,2% ze świeżych malin, truskawek i jagód, a filtracja kolumnowa nie przyniosła żadnego polepszenia efektu. Zmodyfikowana metoda jest skuteczna i oszczędza czas w wykrywaniu wirusowego RNA zarówno ze świeżych, jak i mrożonych jagód. Jako nowa metoda wykrywania i bezpośredniej oceny ilościowej, cyfrowy RT-PCR kropelkowy został porównany z RT-qPCR i był znacznie mniejszy pod wpływem inhibitorów podczas wykrywania mengowirusa w niefiltrowanym RNA z jagód. Jednak w przypadku niskich poziomów czystego RNA RT-qPCR wykazał nieco wyższą czułość i bardziej stabilne wyniki.
Celem tego badania było bezpośrednie wykrycie koronawirusa kotów metodą PCR w czasie rzeczywistym oraz trzema różnymi szybkimi testami immunochromatograficznymi (RIM) wykrywającymi antygeny w próbkach kału kotów ze schronisk.
Na podstawie czułości i swoistości obliczonych dla każdego z testów RIM porównano użyteczność testów RIM. Zbadano siedemdziesiąt próbek kału pochodzących od kotów ze schroniska poddanych kwarantannie. Spośród 70 próbek analizowanych metodą PCR w czasie rzeczywistym 44 (62,9%) było pozytywnych. Znacząco więcej kotów ( p < 0,05) uzyskało wynik pozytywny niż negatywny. Ani wiek, ani płeć kotów nie odgrywały istotnej roli ( p > 0,05) w stanie wydalania wirusa.
Stwierdzono, że czułość testów RIM jest niska (<35%; testy RIM A i C) do poziomu zadowalającego (>50%, test RIM B). Liczba cząstek wirusa określona na podstawie analizy RT-PCR w czasie rzeczywistym nie korelowała istotnie z wynikami wykrytymi w żadnym z testów RIM ( p > 0,05). Wyniki tego badania wskazują, że zastosowanie szybkich testów antygenowych RIM w rutynowych badaniach przesiewowych statusu wydalania FCoV u kotów ze schroniska jest ograniczone ze względu na występowanie dużej liczby wyników fałszywie ujemnych.
COVID-19 to choroba zakaźna, która spowodowała globalną pandemię dotykającą ludzi na całym świecie. Ponieważ wykrywanie chorób i wprowadzanie szczepionek postępują, nadal istnieje zapotrzebowanie na skuteczne narzędzia diagnostyczne, aby zaspokoić potrzeby w zakresie ciągłych testów. W tym wstępnym badaniu oceniono nowy test diagnostyczny SARS-CoV-2 o nazwie DirectDetect SARS-CoV-2 Bezpośrednia reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkryptazą w czasie rzeczywistym (RT-PCR) w oparciu o ograniczoną wielkość próbki 24 próbek oddechowych z 14 SARS-CoV- Pacjenci 2-pozytywni. Test jest korzystniejszy w porównaniu z innymi testami dostępnymi na rynku, ponieważ nie wymaga pożywki transportowej wirusa ani ekstrakcji wirusowego RNA przed amplifikacją i detekcją kwasu nukleinowego.
Ta zdolność przekształca wielogodzinny czas przygotowania próbki w procedurę trwającą kilka minut, jednocześnie eliminując potrzebę stosowania wielu kosztownych odczynników, które mogą być trudne do uzyskania podczas gwałtownego wzrostu liczby testów opartych na kwasach nukleinowych podczas pandemii. Wyniki wskazują na pozytywną zgodność 94,7, 100 i 94,7% między suchymi wymazami z próbkami, próbkami poddanymi działaniu i próbkami niepoddanymi działaniu testowanymi przy użyciu DirectDetect SARS-CoV-2 Direct Real-time RT-PCR w porównaniu z testami stosowanymi w laboratorium klinicznym, odpowiednio.
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL) |
|||
101-T | Viagen | 50 ml | 141 EUR |
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL) |
|||
102-T | Viagen | 100ml | 207 EUR |
DetectX® Creatinine Reagent, 50ML |
|||
C004-50ML | Arbor Assays | 50ML | 359 EUR |
amfiSure Direct PCR Lysis Buffer |
|||
D0300-010 | GenDepot | 100ml | 138 EUR |
mRNAExpress Tail PCR mix (5uM) |
|||
MR-TAIL-PR | SBI | 100 ul | 164 EUR |
Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer |
|||
ABP-PP-MT01100 | Allele Biotech | 100 RXNS | Ask for price |
Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer |
|||
ABP-PP-MT01500 | Allele Biotech | 500 RXNS | Ask for price |
TARGATT? H11 Mouse Tail Lysis PCR Kit |
|||
AST-2005 | Applied StemCell | 100 reactions | 130.6 EUR |
TARGATT? Rosa26 Mouse Tail Lysis PCR Kit |
|||
AST-2006 | Applied StemCell | 100 reactions | 130.6 EUR |
Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit |
|||
ABP-PP-MT02100 | Allele Biotech | 100 RXNS | Ask for price |
Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit |
|||
ABP-PP-MT02500 | Allele Biotech | 500 RXNS | Ask for price |
Assay Buffer, 50ML |
|||
X100-50ML | Arbor Assays | 50ML | 109 EUR |
Assay Buffer, 50ML |
|||
X117-50ML | Arbor Assays | 50ML | 143 EUR |
Extraction Solution, 50ML |
|||
X123-50ML | Arbor Assays | 50ML | 123 EUR |
Purified Water, 50ML |
|||
X137-50ML | Arbor Assays | 50ML | 122 EUR |
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL) |
|||
301-C | Viagen | 50 ml | 141 EUR |
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL) |
|||
302-C | Viagen | 100 ml | 207 EUR |
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR) |
|||
401-E | Viagen | 25 ml | 141 EUR |
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR) |
|||
402-E | Viagen | 50 ml | 207 EUR |
Hemoglobin Sample Diluent, 50ML |
|||
X052-50ML | Arbor Assays | 50ML | 153 EUR |
RBC Lysis Solution 10X |
|||
abx290033-50ml | Abbexa | 50 ml | 230 EUR |
RBC Lysis Solution 10X |
|||
RBC10X-50ML | ImmunoStep | 50 ML | 108.5 EUR |
Folin & Ciocalteu’s phenol reagent |
|||
abx082175-50ml | Abbexa | 50 ml | 189 EUR |
Direct PCR Complete Kit |
|||
S700 | GeneOn | 100 rcs | 133 EUR |
Direct PCR Complete Kit |
|||
S700-2 | GeneOn | 5x100 rcs | 524 EUR |
Plant Direct PCR Kit |
|||
PD105-01 | Vazyme | 50 rxn (50 μl/rxn) | 169 EUR |
Plant Direct PCR Kit |
|||
PD105-02 | Vazyme | 200 rxn (50 μl/rxn) | 354 EUR |
Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free |
|||
X3100-010 | GenDepot | 100ml | 174 EUR |
Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free |
|||
X3100-050 | GenDepot | 500ml | 317 EUR |
Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer |
|||
ABP-PP-BD01100 | Allele Biotech | 100 RXNS | Ask for price |
Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer |
|||
ABP-PP-BD01500 | Allele Biotech | 500 RXNS | Ask for price |
50ML , CONICAL BOTTOMED TUBE WITH CAP, UNASSEMBLED |
|||
SCT-50ML-500 | CORNING | 50/pk | 87 EUR |
Blood Direct PCR Kit V2 |
|||
PD103-01 | Vazyme | 50 rxn | 169 EUR |
Blood Direct PCR Kit V2 |
|||
PD103-02 | Vazyme | 200 rxn | 354 EUR |
SingleStep Poly-HRP Anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP-50ml |
|||
Q2AB1-50ml | EnQuireBio | 50ml | 403 EUR |
SingleStep Poly-HRP Anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP-50ml |
|||
Q2AB2-50ml | EnQuireBio | 50ml | 403 EUR |
REAGENT RESERV, 50ML,WHITE,PS,S,BK,5/200 |
|||
4870 | CORNING | 5/pk | 190 EUR |
REAGENT RESERV,50ML,WHITE,PS,S,IND,1/100 |
|||
4871 | CORNING | 1/pk | 218 EUR |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
|||
B40013 | Bimake | 200 ractions | 209 EUR |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
|||
B40015 | Bimake | 500 ractions | 409 EUR |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
|||
B45012 | Bimake | 1ml*5 (500 ractions) | 280 EUR |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
|||
B45013 | Bimake | 1ml*20 (2000 ractions) | 865 EUR |
50ML , CONICAL BOTTOMED TUBE WITH CAP, ASSEMBLED, PRE-STERILIZED |
|||
SCT-50ML-25-S | CORNING | 25/pk | 98 EUR |
FastAmp Plant Direct PCR Kit - 250 Reactions |
|||
4612 | Intact Genomics | 1/EA | 164 EUR |
Direct RT-PCR Kit wioRealStart DNA Polymerase |
|||
FYT507-100P | Yeastern Biotech | 100 Preps | Ask for price |
Direct RT-PCR Kit wioRealStart DNA Polymerase |
|||
FYT507-50P | Yeastern Biotech | 50 Preps | Ask for price |
50ML , CONICAL BOTTOMED TUBE WITH CAP, RACKED, ASSEMBLED, PRE-STERILIZED |
|||
SCT-50ML-R-S | CORNING | 250/pk | 106 EUR |
Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase |
|||
FYT506-100P | Yeastern Biotech | 100 Preps | Ask for price |
Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase |
|||
FYT506-50P | Yeastern Biotech | 50 Preps; | Ask for price |
Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit |
|||
ABP-PP-BD02100 | Allele Biotech | 100 RXNS | Ask for price |
Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit |
|||
ABP-PP-BD02500 | Allele Biotech | 500 RXNS | Ask for price |
MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit |
|||
PCR-MPX218-48D | Bioingentech | 50T | 453 EUR |
MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit |
|||
PCR-MPX218-96D | Bioingentech | 100T | 572 EUR |
Lysis Buffer |
|||
abx098984-LysisBuffer120ml | Abbexa | Lysis Buffer 1 (20 ml) | 154 EUR |
Lysis Buffer |
|||
abx098984-LysisBuffer3100ml | Abbexa | Lysis Buffer 3 (100ml) | 230 EUR |
Lysis Buffer |
|||
abx098984-LysisBuffer420ml | Abbexa | Lysis Buffer 4 (20 ml) | 154 EUR |
MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit |
|||
PCR-MPX401-48D | Bioingentech | 50T | 453 EUR |
MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit |
|||
PCR-MPX401-96D | Bioingentech | 100T | 572 EUR |
One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD) |
|||
105-540 | GeneOn | 20 rcs x 50 µl | 164 EUR |
One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD) |
|||
105-542 | GeneOn | 100 rcs x 50 µl | 549 EUR |
One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD) |
|||
105-544 | GeneOn | 1000 rcs x 50 µl | 4189 EUR |
Halobacillus PCR kit |
|||
PCR-A635-48D | Bioingentech | 50T | 453 EUR |
Halobacillus PCR kit |
|||
PCR-A635-96D | Bioingentech | 100T | 572 EUR |
Enterovirus PCR kit |
|||
PCR-H433-48R | Bioingentech | 50T | 823 EUR |
Enterovirus PCR kit |
|||
PCR-H433-96R | Bioingentech | 100T | 859 EUR |
Mengovirus PCR kit |
|||
PCR-H453-48R | Bioingentech | 50T | 823 EUR |
Mengovirus PCR kit |
|||
PCR-H453-96R | Bioingentech | 100T | 1113 EUR |
Astrovirus PCR kit |
|||
PCR-H491-48R | Bioingentech | 50T | 823 EUR |
Astrovirus PCR kit |
|||
PCR-H491-96R | Bioingentech | 100T | 1113 EUR |
Calicivirus PCR kit |
|||
PCR-H493-48R | Bioingentech | 50T | 823 EUR |
Calicivirus PCR kit |
|||
PCR-H493-96R | Bioingentech | 100T | 1113 EUR |
Adenovirus PCR kit |
|||
PCR-H501-48D | Bioingentech | 50T | 453 EUR |
Adenovirus PCR kit |
|||
PCR-H501-96D | Bioingentech | 100T | 572 EUR |
Polyomavirus PCR kit |
|||
PCR-H515-48D | Bioingentech | 50T | 453 EUR |
Polyomavirus PCR kit |
|||
PCR-H515-96D | Bioingentech | 100T | 572 EUR |
Ruminococcus PCR kit |
|||
PCR-H619-48D | Bioingentech | 48T | 453 EUR |
Ruminococcus PCR kit |
|||
PCR-H619-96D | Bioingentech | 96T | 572 EUR |
Bifidobacterium PCR kit |
|||
PCR-H621-48D | Bioingentech | 48T | 453 EUR |
Bifidobacterium PCR kit |
|||
PCR-H621-96D | Bioingentech | 96T | 572 EUR |
Sapovirus PCR kit |
|||
PCR-H630-48R | Bioingentech | 50T | 823 EUR |
Sapovirus PCR kit |
|||
PCR-H630-96R | Bioingentech | 100T | 1113 EUR |
Parechovirus PCR kit |
|||
PCR-H642-48R | Bioingentech | 50T | 678 EUR |
Parechovirus PCR kit |
|||
PCR-H642-96R | Bioingentech | 100T | 1113 EUR |
Metapneumovirus PCR kit |
|||
PCR-H643-48R | Bioingentech | 50T | 823 EUR |
Metapneumovirus PCR kit |
|||
PCR-H643-96R | Bioingentech | 100T | 1113 EUR |
Entamoeba PCR kit |
|||
PCR-H683-48D | Bioingentech | 50T | 453 EUR |
Entamoeba PCR kit |
|||
PCR-H683-96D | Bioingentech | 100T | 572 EUR |
Acanthamoeba PCR kit |
|||
PCR-H684-48D | Bioingentech | 50T | 453 EUR |
Acanthamoeba PCR kit |
|||
PCR-H684-96D | Bioingentech | 100T | 572 EUR |
Echovirus PCR kit |
|||
PCR-H722-48D | Bioingentech | 50T | 453 EUR |
Echovirus PCR kit |
|||
PCR-H722-96D | Bioingentech | 100T | 572 EUR |
ranavirus PCR kit |
|||
PCR-V337-48D | Bioingentech | 50T | 453 EUR |
ranavirus PCR kit |
|||
PCR-V337-96D | Bioingentech | 100T | 572 EUR |
Ruminococcus PCR kit |
|||
PCR-V619-48D | Bioingentech | 50T | 425.8 EUR |
Ruminococcus PCR kit |
|||
PCR-V619-96D | Bioingentech | 100T | 521.5 EUR |
Bifidobacterium PCR kit |
|||
PCR-V621-48D | Bioingentech | 50T | 425.8 EUR |
Bifidobacterium PCR kit |
|||
PCR-V621-96D | Bioingentech | 100T | 521.5 EUR |
Burettes Brush, 50ml |
|||
BR004-50 | Bio Basic | 1 UNIT | 51.74 EUR |
CRYOPRESERVATION BAG, 50ML |
|||
91-200-88 | CORNING | 1/pk | 81 EUR |
TubeSpin Bioteactor (50mL) |
|||
TS50 | Next Advance | 180case | 65 EUR |
Odkrycia wskazują, że DirectDetect może być używany do wielu różnych typów próbek przy jednoczesnym zmniejszeniu liczby odczynników i czasu potrzebnego do diagnozy. Chociaż badanie to pokazuje obiecujące wyniki przy użyciu wyników DirectDetect, dalsza walidacja tego testu przy użyciu większego zestawu próbek jest wymagana do oceny rzeczywistej wydajności tego testu.