Pandemia z 2019 r. spowodowana nowym koronawirusem (SARS-CoV-2) nadal szybko rozprzestrzenia się na całym świecie. Amplifikacja kwasu nukleinowego służy jako złoty standard metody potwierdzania zakażenia COVID-19. Jednak wyzwania stojące przed laboratoriami diagnostycznymi z krajów nierozwiniętych obejmują brak zestawów i materiałów do oczyszczania wirusowego RNA. Dlatego pilnie należy zweryfikować alternatywne metody izolacji kwasów nukleinowych dla SARS-CoV-2.
Nasze wyniki pokazują, że stężony bufor do amplifikacji lizy wirusa (vLAB) przygotowany z niejonowym detergentem IGEPAL umożliwia jakościowe wykrywanie SARS-CoV-2 przez bezpośrednią reakcję łańcuchową odwrotnej transkryptazy-polimerazy (dRT-PCR). Ponadto vLAB skutecznie inaktywował SARS-CoV-2. Ponieważ metoda ta jest niedroga i nie jest wymagany sprzęt do oczyszczania RNA ani dodatkowa synteza cDNA, to dRT-PCR z vLAB należy rozważyć jako alternatywną metodę jakościowego wykrywania SARS-CoV-2.
Liza komórek, a następnie uwolnienie genomowego DNA to ciągły dylemat technik biologii molekularnej.
W większości przypadków technologie takie jak PCR i inne techniki amplifikacji wymagają etapów ekstrakcji i oczyszczania DNA. Proces inteligentnej amplifikacji w wersji 2 (SmartAmp2) to izotermiczna i zintegrowana technologia amplifikacji, która eliminuje potrzebę czasochłonnego przygotowywania próbek w celu szybkiego wykrywania kwasów nukleinowych, w tym polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP), mutacji i innych celów. Ponadto amplifikacja DNA bezpośrednio z pełnej krwi jest korzystna i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego. Tradycyjne testy SmartAmp2 obejmują dwa etapy i wymagają wstępnej obróbki alkalicznej w temperaturze 98 stopni C przed przebiegiem w temperaturze 60 stopni.
Aby uczynić SmartAmp2 prawdziwie izotermicznym i uprościć amplifikację DNA, niniejszym wprowadzamy SmartAmp Isothermal Lysis Buffer (SIL-B), nowo opracowany chaotropowy bufor do lizy, który umożliwia jednoczesne odzyskiwanie i denaturację materiału genomowego bezpośrednio z pełnej krwi w jednolitych 60 stopniach C. Udoskonalona metoda izolowania kwasów nukleinowych z krwi pełnej jest kamieniem milowym w tworzeniu prawdziwie izotermicznego wzmacniacza SmartAmp2 od początku do końca w jednej temperaturze, zwiększając jego potencjał do rutynowego stosowania w terenowych testach przyłóżkowych. Ponadto wstępne traktowanie SIL-B umożliwia amplifikację PCR materiału genomowego bezpośrednio z pełnej krwi.
Wykrywanie wirusów na jagodach jest trudnym zadaniem, często utrudnionym przez obecność substancji hamujących RT-qPCR z soku z jagód.
Wcześniej opublikowano metodę bezpośredniej ekstrakcji do wykrywania wirusów (mysiego norowirusa i faga GA) z mrożonych malin. Rozbudowaliśmy (różne rodzaje jagód i wirusów) i ulepszyliśmy metodę za pomocą kolumn MobiSpin S400, które filtrują kwasy nukleinowe w oparciu o chromatografię wykluczenia. Chociaż w przefiltrowanym RNA nie wykryto hamowania, niefiltrowany RNA wymagał rozcieńczenia od 1:2 do ponad 1:8 w celu usunięcia hamowania. Zmodyfikowana metoda dała odzyskanie norowirusa bydła około 40,8 ± 4,5% (40,0 ± 7,0%), 48,0 ± 26,0% (50,5 ± 7,8%), 28,3 ± 2,6% (45,8 ± 6,6%) z mrożonych (świeżych) malin, truskawek i odpowiednio jagody. W przypadku tych samych próbek odzyski wirusa zapalenia wątroby typu A wynosiły 34,0 ± 5,9% (34,0 ± 6,0%), 40,0 ± 13,3% (34,2 ± 10,5%) i 23,0 ± 6,8% (31,5 ± 7,9%).
W przypadku adenowirusa 40 (wirus DNA) odzyski wynosiły odpowiednio 21,2 ± 8,6%, 16,0 ± 3,2% i 5,7 ± 0,2% ze świeżych malin, truskawek i jagód, a filtracja kolumnowa nie przyniosła żadnego polepszenia efektu. Zmodyfikowana metoda jest skuteczna i oszczędza czas w wykrywaniu wirusowego RNA zarówno ze świeżych, jak i mrożonych jagód. Jako nowa metoda wykrywania i bezpośredniej oceny ilościowej, cyfrowy RT-PCR kropelkowy został porównany z RT-qPCR i był znacznie mniejszy pod wpływem inhibitorów podczas wykrywania mengowirusa w niefiltrowanym RNA z jagód. Jednak w przypadku niskich poziomów czystego RNA RT-qPCR wykazał nieco wyższą czułość i bardziej stabilne wyniki.
Celem tego badania było bezpośrednie wykrycie koronawirusa kotów metodą PCR w czasie rzeczywistym oraz trzema różnymi szybkimi testami immunochromatograficznymi (RIM) wykrywającymi antygeny w próbkach kału kotów ze schronisk.
Na podstawie czułości i swoistości obliczonych dla każdego z testów RIM porównano użyteczność testów RIM. Zbadano siedemdziesiąt próbek kału pochodzących od kotów ze schroniska poddanych kwarantannie. Spośród 70 próbek analizowanych metodą PCR w czasie rzeczywistym 44 (62,9%) było pozytywnych. Znacząco więcej kotów ( p < 0,05) uzyskało wynik pozytywny niż negatywny. Ani wiek, ani płeć kotów nie odgrywały istotnej roli ( p > 0,05) w stanie wydalania wirusa.
Stwierdzono, że czułość testów RIM jest niska (<35%; testy RIM A i C) do poziomu zadowalającego (>50%, test RIM B). Liczba cząstek wirusa określona na podstawie analizy RT-PCR w czasie rzeczywistym nie korelowała istotnie z wynikami wykrytymi w żadnym z testów RIM ( p > 0,05). Wyniki tego badania wskazują, że zastosowanie szybkich testów antygenowych RIM w rutynowych badaniach przesiewowych statusu wydalania FCoV u kotów ze schroniska jest ograniczone ze względu na występowanie dużej liczby wyników fałszywie ujemnych.
COVID-19 to choroba zakaźna, która spowodowała globalną pandemię dotykającą ludzi na całym świecie. Ponieważ wykrywanie chorób i wprowadzanie szczepionek postępują, nadal istnieje zapotrzebowanie na skuteczne narzędzia diagnostyczne, aby zaspokoić potrzeby w zakresie ciągłych testów. W tym wstępnym badaniu oceniono nowy test diagnostyczny SARS-CoV-2 o nazwie DirectDetect SARS-CoV-2 Bezpośrednia reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkryptazą w czasie rzeczywistym (RT-PCR) w oparciu o ograniczoną wielkość próbki 24 próbek oddechowych z 14 SARS-CoV- Pacjenci 2-pozytywni. Test jest korzystniejszy w porównaniu z innymi testami dostępnymi na rynku, ponieważ nie wymaga pożywki transportowej wirusa ani ekstrakcji wirusowego RNA przed amplifikacją i detekcją kwasu nukleinowego.
Ta zdolność przekształca wielogodzinny czas przygotowania próbki w procedurę trwającą kilka minut, jednocześnie eliminując potrzebę stosowania wielu kosztownych odczynników, które mogą być trudne do uzyskania podczas gwałtownego wzrostu liczby testów opartych na kwasach nukleinowych podczas pandemii. Wyniki wskazują na pozytywną zgodność 94,7, 100 i 94,7% między suchymi wymazami z próbkami, próbkami poddanymi działaniu i próbkami niepoddanymi działaniu testowanymi przy użyciu DirectDetect SARS-CoV-2 Direct Real-time RT-PCR w porównaniu z testami stosowanymi w laboratorium klinicznym, odpowiednio.
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL) |
|||
101-T | Cusabio | 50 ml | 169.2 EUR |
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL) |
|||
102-T | Viagen | 100ml | 248.4 EUR |
DetectX® Creatinine Reagent, 50ML |
|||
C004-50ML | Arbor Assays | 50ML | 430.8 EUR |
amfiSure Direct PCR Lysis Buffer |
|||
D0300-010 | GenDepot | 100ml | 165.6 EUR |
mRNAExpress Tail PCR mix (5uM) |
|||
MR-TAIL-PR | SBI | 100 ul | 196.8 EUR |
Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer |
|||
ABP-PP-MT01100 | Allele Biotech | 100 RXNS | Ask for price |
Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer |
|||
ABP-PP-MT01500 | Allele Biotech | 500 RXNS | Ask for price |
TARGATT? H11 Mouse Tail Lysis PCR Kit |
|||
AST-2005 | Applied StemCell | 100 reactions | 156.72 EUR |
TARGATT? Rosa26 Mouse Tail Lysis PCR Kit |
|||
AST-2006 | Applied StemCell | 100 reactions | 156.72 EUR |
Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit |
|||
ABP-PP-MT02100 | Allele Biotech | 100 RXNS | Ask for price |
Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit |
|||
ABP-PP-MT02500 | Allele Biotech | 500 RXNS | Ask for price |
Reagent Reservoir 50ml |
|||
F267670 | Scientific Laboratory Supplies | PK100 | 232.56 EUR |
RBC Lysis Solution 10X |
|||
abx290033-50ml | Abbexa | 50 ml | 276 EUR |
RBC Lysis Solution 10X |
|||
RBC10X-50ML | ImmunoStep | 50 ML | 130.2 EUR |
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR) |
|||
401-E | Viagen | 25 ml | 169.2 EUR |
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR) |
|||
402-E | Viagen | 50 ml | 248.4 EUR |
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL) |
|||
301-C | Viagen | 50 ml | 169.2 EUR |
DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL) |
|||
302-C | Viagen | 100 ml | 248.4 EUR |
Assay Buffer, 50ML |
|||
X100-50ML | Arbor Assays | 50ML | 130.8 EUR |
Assay Buffer, 50ML |
|||
X117-50ML | Arbor Assays | 50ML | 171.6 EUR |
Extraction Solution, 50ML |
|||
X123-50ML | Arbor Assays | 50ML | 147.6 EUR |
Purified Water, 50ML |
|||
X137-50ML | Arbor Assays | 50ML | 146.4 EUR |
Hemoglobin Sample Diluent, 50ML |
|||
X052-50ML | Arbor Assays | 50ML | 183.6 EUR |
Bottle Reagent Simax 50ml |
|||
BOT53020 | Scientific Laboratory Supplies | PK10 | 56.66 EUR |
Bottle Pyrex Reagent 50ml. |
|||
1516/02D | Scientific Laboratory Supplies | PK10 | 92.76 EUR |
Folin & Ciocalteu’s phenol reagent |
|||
abx082175-50ml | Abbexa | 50 ml | 226.8 EUR |
Plant Direct PCR Kit |
|||
PD105-01 | Vazyme | 50 rxn (50 μl/rxn) | 202.8 EUR |
Plant Direct PCR Kit |
|||
PD105-02 | Vazyme | 200 rxn (50 μl/rxn) | 424.8 EUR |
Direct PCR Complete Kit |
|||
S700 | GeneOn | 100 rcs | 159.6 EUR |
Direct PCR Complete Kit |
|||
S700-2 | GeneOn | 5x100 rcs | 628.8 EUR |
Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer |
|||
ABP-PP-BD01100 | Allele Biotech | 100 RXNS | Ask for price |
Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer |
|||
ABP-PP-BD01500 | Allele Biotech | 500 RXNS | Ask for price |
Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free |
|||
X3100-010 | GenDepot | 100ml | 208.8 EUR |
Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free |
|||
X3100-050 | GenDepot | 500ml | 380.4 EUR |
Blood Direct PCR Kit V2 |
|||
PD103-01 | Vazyme | 50 rxn | 202.8 EUR |
Blood Direct PCR Kit V2 |
|||
PD103-02 | Vazyme | 200 rxn | 424.8 EUR |
50ML , CONICAL BOTTOMED TUBE WITH CAP, UNASSEMBLED |
|||
SCT-50ML-500 | CORNING | 50/pk | 104.4 EUR |
SingleStep Poly-HRP Anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP-50ml |
|||
Q2AB1-50ml | EnQuireBio | 50ml | 483.6 EUR |
SingleStep Poly-HRP Anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP-50ml |
|||
Q2AB2-50ml | EnQuireBio | 50ml | 483.6 EUR |
Costar 50mL Reagent Reservoirs 5/Bag Sterile |
|||
4870 | Scientific Laboratory Supplies | PK200 | 279.3 EUR |
Costar 50mL Reagent Reservoirs 1/Bag Sterile |
|||
4871 | Scientific Laboratory Supplies | PK100 | 323.76 EUR |
Simax Reagent Bottle Narrow Mouth Amber 50ml |
|||
BOT64222 | Scientific Laboratory Supplies | PK10 | 52.1 EUR |
Select Reagent Bottle Wide Mouth Clear 50ml |
|||
BOT64420 | Scientific Laboratory Supplies | PK10 | 52.1 EUR |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
|||
B40013 | Bimake | 200 ractions | 250.8 EUR |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
|||
B40015 | Bimake | 500 ractions | 490.8 EUR |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
|||
B45012 | Bimake | 1ml*5 (500 ractions) | 336 EUR |
Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping) |
|||
B45013 | Bimake | 1ml*20 (2000 ractions) | 1038 EUR |
AxyPrep Mag PCR Normaliser- 50mL |
|||
AXY1054 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 1633.62 EUR |
FastAmp Plant Direct PCR Kit - 1250 Reactions |
|||
4615 | Intact Genomics | 1/EA | 621.6 EUR |
Direct RT-PCR Kit wioRealStart DNA Polymerase |
|||
FYT507-100P | Yeastern Biotech | 100 Preps | Ask for price |
Direct RT-PCR Kit wioRealStart DNA Polymerase |
|||
FYT507-50P | Yeastern Biotech | 50 Preps | Ask for price |
AxyPrep Mag PCR clean up -50mL |
|||
AXY1046 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 1511.64 EUR |
Reagent Bottle Clear Narrow neck with plastic stopper 50ml |
|||
BOT2140 | Scientific Laboratory Supplies | PK10 | 38.19 EUR |
Reagent Bottle Amber Narrow neck with plastic stopper 50ml |
|||
BOT2156 | Scientific Laboratory Supplies | PK10 | 44.57 EUR |
50ML , CONICAL BOTTOMED TUBE WITH CAP, ASSEMBLED, PRE-STERILIZED |
|||
SCT-50ML-25-S | CORNING | 25/pk | 117.6 EUR |
PCR Tubes (50) |
|||
PCR-50 | BioAssay Systems | 50 | 15 EUR |
Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit |
|||
ABP-PP-BD02100 | Allele Biotech | 100 RXNS | Ask for price |
Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit |
|||
ABP-PP-BD02500 | Allele Biotech | 500 RXNS | Ask for price |
Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase |
|||
FYT506-100P | Yeastern Biotech | 100 Preps | Ask for price |
Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase |
|||
FYT506-50P | Yeastern Biotech | 50 Preps; | Ask for price |
50ML , CONICAL BOTTOMED TUBE WITH CAP, RACKED, ASSEMBLED, PRE-STERILIZED |
|||
SCT-50ML-R-S | CORNING | 250/pk | 127.2 EUR |
MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit |
|||
PCR-MPX218-48D | Bioingentech | 50T | 543.6 EUR |
MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit |
|||
PCR-MPX218-96D | Bioingentech | 100T | 686.4 EUR |
Lysis Buffer |
|||
abx098984-LysisBuffer120ml | Abbexa | Lysis Buffer 1 (20 ml) | 184.8 EUR |
Lysis Buffer |
|||
abx098984-LysisBuffer3100ml | Abbexa | Lysis Buffer 3 (100ml) | 276 EUR |
Lysis Buffer |
|||
abx098984-LysisBuffer420ml | Abbexa | Lysis Buffer 4 (20 ml) | 184.8 EUR |
MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit |
|||
PCR-MPX401-48D | Bioingentech | 50T | 543.6 EUR |
MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit |
|||
PCR-MPX401-96D | Bioingentech | 100T | 686.4 EUR |
ranavirus PCR kit |
|||
PCR-V337-48D | Bioingentech | 50T | 543.6 EUR |
ranavirus PCR kit |
|||
PCR-V337-96D | Bioingentech | 100T | 686.4 EUR |
Ruminococcus PCR kit |
|||
PCR-V619-48D | Bioingentech | 50T | 510.96 EUR |
Ruminococcus PCR kit |
|||
PCR-V619-96D | Bioingentech | 100T | 625.8 EUR |
Bifidobacterium PCR kit |
|||
PCR-V621-48D | Bioingentech | 50T | 510.96 EUR |
Bifidobacterium PCR kit |
|||
PCR-V621-96D | Bioingentech | 100T | 625.8 EUR |
Halobacillus PCR kit |
|||
PCR-A635-48D | Bioingentech | 50T | 543.6 EUR |
Halobacillus PCR kit |
|||
PCR-A635-96D | Bioingentech | 100T | 686.4 EUR |
Enterovirus PCR kit |
|||
PCR-H433-48R | Bioingentech | 50T | 987.6 EUR |
Enterovirus PCR kit |
|||
PCR-H433-96R | Bioingentech | 100T | 1030.8 EUR |
Mengovirus PCR kit |
|||
PCR-H453-48R | Bioingentech | 50T | 987.6 EUR |
Mengovirus PCR kit |
|||
PCR-H453-96R | Bioingentech | 100T | 1335.6 EUR |
Astrovirus PCR kit |
|||
PCR-H491-48R | Bioingentech | 50T | 987.6 EUR |
Astrovirus PCR kit |
|||
PCR-H491-96R | Bioingentech | 100T | 1335.6 EUR |
Calicivirus PCR kit |
|||
PCR-H493-48R | Bioingentech | 50T | 987.6 EUR |
Calicivirus PCR kit |
|||
PCR-H493-96R | Bioingentech | 100T | 1335.6 EUR |
Adenovirus PCR kit |
|||
PCR-H501-48D | Bioingentech | 50T | 543.6 EUR |
Adenovirus PCR kit |
|||
PCR-H501-96D | Bioingentech | 100T | 686.4 EUR |
Polyomavirus PCR kit |
|||
PCR-H515-48D | Bioingentech | 50T | 543.6 EUR |
Polyomavirus PCR kit |
|||
PCR-H515-96D | Bioingentech | 100T | 686.4 EUR |
Ruminococcus PCR kit |
|||
PCR-H619-48D | Bioingentech | 48T | 543.6 EUR |
Ruminococcus PCR kit |
|||
PCR-H619-96D | Bioingentech | 96T | 686.4 EUR |
Bifidobacterium PCR kit |
|||
PCR-H621-48D | Bioingentech | 48T | 543.6 EUR |
Bifidobacterium PCR kit |
|||
PCR-H621-96D | Bioingentech | 96T | 686.4 EUR |
Sapovirus PCR kit |
|||
PCR-H630-48R | Bioingentech | 50T | 987.6 EUR |
Sapovirus PCR kit |
|||
PCR-H630-96R | Bioingentech | 100T | 1335.6 EUR |
Parechovirus PCR kit |
|||
PCR-H642-48R | Bioingentech | 50T | 813.6 EUR |
Parechovirus PCR kit |
|||
PCR-H642-96R | Bioingentech | 100T | 1335.6 EUR |
Metapneumovirus PCR kit |
|||
PCR-H643-48R | Bioingentech | 50T | 987.6 EUR |
Metapneumovirus PCR kit |
|||
PCR-H643-96R | Bioingentech | 100T | 1335.6 EUR |
Entamoeba PCR kit |
|||
PCR-H683-48D | Bioingentech | 50T | 543.6 EUR |
Entamoeba PCR kit |
|||
PCR-H683-96D | Bioingentech | 100T | 686.4 EUR |
Odkrycia wskazują, że DirectDetect może być używany do wielu różnych typów próbek przy jednoczesnym zmniejszeniu liczby odczynników i czasu potrzebnego do diagnozy. Chociaż badanie to pokazuje obiecujące wyniki przy użyciu wyników DirectDetect, dalsza walidacja tego testu przy użyciu większego zestawu próbek jest wymagana do oceny rzeczywistej wydajności tego testu.