Pandemia z 2019 r. spowodowana nowym koronawirusem (SARS-CoV-2) nadal szybko rozprzestrzenia się na całym świecie. Amplifikacja kwasu nukleinowego służy jako złoty standard metody potwierdzania zakażenia COVID-19. Jednak wyzwania stojące przed laboratoriami diagnostycznymi z krajów nierozwiniętych obejmują brak zestawów i materiałów do oczyszczania wirusowego RNA. Dlatego pilnie należy zweryfikować alternatywne metody izolacji kwasów nukleinowych dla SARS-CoV-2.

Nasze wyniki pokazują, że stężony bufor do amplifikacji lizy wirusa (vLAB) przygotowany z niejonowym detergentem IGEPAL umożliwia jakościowe wykrywanie SARS-CoV-2 przez bezpośrednią reakcję łańcuchową odwrotnej transkryptazy-polimerazy (dRT-PCR). Ponadto vLAB skutecznie inaktywował SARS-CoV-2. Ponieważ metoda ta jest niedroga i nie jest wymagany sprzęt do oczyszczania RNA ani dodatkowa synteza cDNA, to dRT-PCR z vLAB należy rozważyć jako alternatywną metodę jakościowego wykrywania SARS-CoV-2.

Liza komórek, a następnie uwolnienie genomowego DNA to ciągły dylemat technik biologii molekularnej.

W większości przypadków technologie takie jak PCR i inne techniki amplifikacji wymagają etapów ekstrakcji i oczyszczania DNA. Proces inteligentnej amplifikacji w wersji 2 (SmartAmp2) to izotermiczna i zintegrowana technologia amplifikacji, która eliminuje potrzebę czasochłonnego przygotowywania próbek w celu szybkiego wykrywania kwasów nukleinowych, w tym polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP), mutacji i innych celów. Ponadto amplifikacja DNA bezpośrednio z pełnej krwi jest korzystna i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego. Tradycyjne testy SmartAmp2 obejmują dwa etapy i wymagają wstępnej obróbki alkalicznej w temperaturze 98 stopni C przed przebiegiem w temperaturze 60 stopni.

Aby uczynić SmartAmp2 prawdziwie izotermicznym i uprościć amplifikację DNA, niniejszym wprowadzamy SmartAmp Isothermal Lysis Buffer (SIL-B), nowo opracowany chaotropowy bufor do lizy, który umożliwia jednoczesne odzyskiwanie i denaturację materiału genomowego bezpośrednio z pełnej krwi w jednolitych 60 stopniach C. Udoskonalona metoda izolowania kwasów nukleinowych z krwi pełnej jest kamieniem milowym w tworzeniu prawdziwie izotermicznego wzmacniacza SmartAmp2 od początku do końca w jednej temperaturze, zwiększając jego potencjał do rutynowego stosowania w terenowych testach przyłóżkowych. Ponadto wstępne traktowanie SIL-B umożliwia amplifikację PCR materiału genomowego bezpośrednio z pełnej krwi.

Wykrywanie wirusów na jagodach jest trudnym zadaniem, często utrudnionym przez obecność substancji hamujących RT-qPCR z soku z jagód.

Wcześniej opublikowano metodę bezpośredniej ekstrakcji do wykrywania wirusów (mysiego norowirusa i faga GA) z mrożonych malin. Rozbudowaliśmy (różne rodzaje jagód i wirusów) i ulepszyliśmy metodę za pomocą kolumn MobiSpin S400, które filtrują kwasy nukleinowe w oparciu o chromatografię wykluczenia. Chociaż w przefiltrowanym RNA nie wykryto hamowania, niefiltrowany RNA wymagał rozcieńczenia od 1:2 do ponad 1:8 w celu usunięcia hamowania. Zmodyfikowana metoda dała odzyskanie norowirusa bydła około 40,8 ± 4,5% (40,0 ± 7,0%), 48,0 ± 26,0% (50,5 ± 7,8%), 28,3 ± 2,6% (45,8 ± 6,6%) z mrożonych (świeżych) malin, truskawek i odpowiednio jagody. W przypadku tych samych próbek odzyski wirusa zapalenia wątroby typu A wynosiły 34,0 ± 5,9% (34,0 ± 6,0%), 40,0 ± 13,3% (34,2 ± 10,5%) i 23,0 ± 6,8% (31,5 ± 7,9%).

W przypadku adenowirusa 40 (wirus DNA) odzyski wynosiły odpowiednio 21,2 ± 8,6%, 16,0 ± 3,2% i 5,7 ± 0,2% ze świeżych malin, truskawek i jagód, a filtracja kolumnowa nie przyniosła żadnego polepszenia efektu. Zmodyfikowana metoda jest skuteczna i oszczędza czas w wykrywaniu wirusowego RNA zarówno ze świeżych, jak i mrożonych jagód. Jako nowa metoda wykrywania i bezpośredniej oceny ilościowej, cyfrowy RT-PCR kropelkowy został porównany z RT-qPCR i był znacznie mniejszy pod wpływem inhibitorów podczas wykrywania mengowirusa w niefiltrowanym RNA z jagód. Jednak w przypadku niskich poziomów czystego RNA RT-qPCR wykazał nieco wyższą czułość i bardziej stabilne wyniki.

Celem tego badania było bezpośrednie wykrycie koronawirusa kotów metodą PCR w czasie rzeczywistym oraz trzema różnymi szybkimi testami immunochromatograficznymi (RIM) wykrywającymi antygeny w próbkach kału kotów ze schronisk.

Na podstawie czułości i swoistości obliczonych dla każdego z testów RIM porównano użyteczność testów RIM. Zbadano siedemdziesiąt próbek kału pochodzących od kotów ze schroniska poddanych kwarantannie. Spośród 70 próbek analizowanych metodą PCR w czasie rzeczywistym 44 (62,9%) było pozytywnych. Znacząco więcej kotów ( p  < 0,05) uzyskało wynik pozytywny niż negatywny. Ani wiek, ani płeć kotów nie odgrywały istotnej roli ( p  > 0,05) w stanie wydalania wirusa.

Stwierdzono, że czułość testów RIM jest niska (<35%; testy RIM A i C) do poziomu zadowalającego (>50%, test RIM B). Liczba cząstek wirusa określona na podstawie analizy RT-PCR w czasie rzeczywistym nie korelowała istotnie z wynikami wykrytymi w żadnym z testów RIM ( p  > 0,05). Wyniki tego badania wskazują, że zastosowanie szybkich testów antygenowych RIM w rutynowych badaniach przesiewowych statusu wydalania FCoV u kotów ze schroniska jest ograniczone ze względu na występowanie dużej liczby wyników fałszywie ujemnych.

COVID-19 to choroba zakaźna, która spowodowała globalną pandemię dotykającą ludzi na całym świecie. Ponieważ wykrywanie chorób i wprowadzanie szczepionek postępują, nadal istnieje zapotrzebowanie na skuteczne narzędzia diagnostyczne, aby zaspokoić potrzeby w zakresie ciągłych testów. W tym wstępnym badaniu oceniono nowy test diagnostyczny SARS-CoV-2 o nazwie DirectDetect SARS-CoV-2 Bezpośrednia reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkryptazą w czasie rzeczywistym (RT-PCR) w oparciu o ograniczoną wielkość próbki 24 próbek oddechowych z 14 SARS-CoV- Pacjenci 2-pozytywni. Test jest korzystniejszy w porównaniu z innymi testami dostępnymi na rynku, ponieważ nie wymaga pożywki transportowej wirusa ani ekstrakcji wirusowego RNA przed amplifikacją i detekcją kwasu nukleinowego.

Ta zdolność przekształca wielogodzinny czas przygotowania próbki w procedurę trwającą kilka minut, jednocześnie eliminując potrzebę stosowania wielu kosztownych odczynników, które mogą być trudne do uzyskania podczas gwałtownego wzrostu liczby testów opartych na kwasach nukleinowych podczas pandemii. Wyniki wskazują na pozytywną zgodność 94,7, 100 i 94,7% między suchymi wymazami z próbkami, próbkami poddanymi działaniu i próbkami niepoddanymi działaniu testowanymi przy użyciu DirectDetect SARS-CoV-2 Direct Real-time RT-PCR w porównaniu z testami stosowanymi w laboratorium klinicznym, odpowiednio.

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL)

101-T Viagen 50 ml 141 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL)

102-T Viagen 100ml 207 EUR

DetectX® Creatinine Reagent, 50ML

C004-50ML Arbor Assays 50ML 359 EUR

amfiSure Direct PCR Lysis Buffer

D0300-010 GenDepot 100ml 138 EUR

mRNAExpress Tail PCR mix (5uM)

MR-TAIL-PR SBI 100 ul 164 EUR

Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer

ABP-PP-MT01100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer

ABP-PP-MT01500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

TARGATT? H11 Mouse Tail Lysis PCR Kit

AST-2005 Applied StemCell 100 reactions 130.6 EUR

TARGATT? Rosa26 Mouse Tail Lysis PCR Kit

AST-2006 Applied StemCell 100 reactions 130.6 EUR

Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit

ABP-PP-MT02100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit

ABP-PP-MT02500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

Assay Buffer, 50ML

X100-50ML Arbor Assays 50ML 109 EUR

Assay Buffer, 50ML

X117-50ML Arbor Assays 50ML 143 EUR

Extraction Solution, 50ML

X123-50ML Arbor Assays 50ML 123 EUR

Purified Water, 50ML

X137-50ML Arbor Assays 50ML 122 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL)

301-C Viagen 50 ml 141 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL)

302-C Viagen 100 ml 207 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR)

401-E Viagen 25 ml 141 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR)

402-E Viagen 50 ml 207 EUR

Hemoglobin Sample Diluent, 50ML

X052-50ML Arbor Assays 50ML 153 EUR

RBC Lysis Solution 10X

abx290033-50ml Abbexa 50 ml 230 EUR

RBC Lysis Solution 10X

RBC10X-50ML ImmunoStep 50 ML 108.5 EUR

Folin & Ciocalteu’s phenol reagent

abx082175-50ml Abbexa 50 ml 189 EUR

Direct PCR Complete Kit

S700 GeneOn 100 rcs 133 EUR

Direct PCR Complete Kit

S700-2 GeneOn 5x100 rcs 524 EUR

Plant Direct PCR Kit

PD105-01 Vazyme 50 rxn (50 μl/rxn) 169 EUR

Plant Direct PCR Kit

PD105-02 Vazyme 200 rxn (50 μl/rxn) 354 EUR

Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free

X3100-010 GenDepot 100ml 174 EUR

Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free

X3100-050 GenDepot 500ml 317 EUR

Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer

ABP-PP-BD01100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer

ABP-PP-BD01500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

50ML , CONICAL BOTTOMED TUBE WITH CAP, UNASSEMBLED

SCT-50ML-500 CORNING 50/pk 87 EUR

Blood Direct PCR Kit V2

PD103-01 Vazyme 50 rxn 169 EUR

Blood Direct PCR Kit V2

PD103-02 Vazyme 200 rxn 354 EUR

SingleStep Poly-HRP Anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP-50ml

Q2AB1-50ml EnQuireBio 50ml 403 EUR

SingleStep Poly-HRP Anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP-50ml

Q2AB2-50ml EnQuireBio 50ml 403 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B40013 Bimake 200 ractions 209 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B40015 Bimake 500 ractions 409 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B45012 Bimake 1ml*5 (500 ractions) 280 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)

B45013 Bimake 1ml*20 (2000 ractions) 865 EUR

REAGENT RESERV, 50ML,WHITE,PS,S,BK,5/200

4870 CORNING 5/pk 190 EUR

REAGENT RESERV,50ML,WHITE,PS,S,IND,1/100

4871 CORNING 1/pk 218 EUR

50ML , CONICAL BOTTOMED TUBE WITH CAP, ASSEMBLED, PRE-STERILIZED

SCT-50ML-25-S CORNING 25/pk 98 EUR

Direct RT-PCR Kit wioRealStart DNA Polymerase

FYT507-100P Yeastern Biotech 100 Preps Ask for price

Direct RT-PCR Kit wioRealStart DNA Polymerase

FYT507-50P Yeastern Biotech 50 Preps Ask for price

FastAmp Plant Direct PCR Kit - 250 Reactions

4612 Intact Genomics 1/EA 164 EUR

50ML , CONICAL BOTTOMED TUBE WITH CAP, RACKED, ASSEMBLED, PRE-STERILIZED

SCT-50ML-R-S CORNING 250/pk 106 EUR

Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase

FYT506-100P Yeastern Biotech 100 Preps Ask for price

Direct RT-PCR Kit wi RealStart DNA Polymerase

FYT506-50P Yeastern Biotech 50 Preps; Ask for price

Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit

ABP-PP-BD02100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit

ABP-PP-BD02500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit

PCR-MPX218-48D Bioingentech 50T 453 EUR

MULTIPLEX KIT PCR MASTITIS PCR kit

PCR-MPX218-96D Bioingentech 100T 572 EUR

Lysis Buffer

abx098984-LysisBuffer120ml Abbexa Lysis Buffer 1 (20 ml) 154 EUR

Lysis Buffer

abx098984-LysisBuffer3100ml Abbexa Lysis Buffer 3 (100ml) 230 EUR

Lysis Buffer

abx098984-LysisBuffer420ml Abbexa Lysis Buffer 4 (20 ml) 154 EUR

MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit

PCR-MPX401-48D Bioingentech 50T 453 EUR

MULTIPLEX KIT PCR Babesia & Theileria PCR kit

PCR-MPX401-96D Bioingentech 100T 572 EUR

Halobacillus PCR kit

PCR-A635-48D Bioingentech 50T 453 EUR

Halobacillus PCR kit

PCR-A635-96D Bioingentech 100T 572 EUR

Enterovirus PCR kit

PCR-H433-48R Bioingentech 50T 823 EUR

Enterovirus PCR kit

PCR-H433-96R Bioingentech 100T 859 EUR

Mengovirus PCR kit

PCR-H453-48R Bioingentech 50T 823 EUR

Mengovirus PCR kit

PCR-H453-96R Bioingentech 100T 1113 EUR

Astrovirus PCR kit

PCR-H491-48R Bioingentech 50T 823 EUR

Astrovirus PCR kit

PCR-H491-96R Bioingentech 100T 1113 EUR

Calicivirus PCR kit

PCR-H493-48R Bioingentech 50T 823 EUR

Calicivirus PCR kit

PCR-H493-96R Bioingentech 100T 1113 EUR

Adenovirus PCR kit

PCR-H501-48D Bioingentech 50T 453 EUR

Adenovirus PCR kit

PCR-H501-96D Bioingentech 100T 572 EUR

Polyomavirus PCR kit

PCR-H515-48D Bioingentech 50T 453 EUR

Polyomavirus PCR kit

PCR-H515-96D Bioingentech 100T 572 EUR

Ruminococcus PCR kit

PCR-H619-48D Bioingentech 48T 453 EUR

Ruminococcus PCR kit

PCR-H619-96D Bioingentech 96T 572 EUR

Bifidobacterium PCR kit

PCR-H621-48D Bioingentech 48T 453 EUR

Bifidobacterium PCR kit

PCR-H621-96D Bioingentech 96T 572 EUR

Sapovirus PCR kit

PCR-H630-48R Bioingentech 50T 823 EUR

Sapovirus PCR kit

PCR-H630-96R Bioingentech 100T 1113 EUR

Parechovirus PCR kit

PCR-H642-48R Bioingentech 50T 678 EUR

Parechovirus PCR kit

PCR-H642-96R Bioingentech 100T 1113 EUR

Metapneumovirus PCR kit

PCR-H643-48R Bioingentech 50T 823 EUR

Metapneumovirus PCR kit

PCR-H643-96R Bioingentech 100T 1113 EUR

Entamoeba PCR kit

PCR-H683-48D Bioingentech 50T 453 EUR

Entamoeba PCR kit

PCR-H683-96D Bioingentech 100T 572 EUR

Acanthamoeba PCR kit

PCR-H684-48D Bioingentech 50T 453 EUR

Acanthamoeba PCR kit

PCR-H684-96D Bioingentech 100T 572 EUR

Echovirus PCR kit

PCR-H722-48D Bioingentech 50T 453 EUR

Echovirus PCR kit

PCR-H722-96D Bioingentech 100T 572 EUR

ranavirus PCR kit

PCR-V337-48D Bioingentech 50T 453 EUR

ranavirus PCR kit

PCR-V337-96D Bioingentech 100T 572 EUR

Ruminococcus PCR kit

PCR-V619-48D Bioingentech 50T 425.8 EUR

Ruminococcus PCR kit

PCR-V619-96D Bioingentech 100T 521.5 EUR

Bifidobacterium PCR kit

PCR-V621-48D Bioingentech 50T 425.8 EUR

Bifidobacterium PCR kit

PCR-V621-96D Bioingentech 100T 521.5 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)

105-540 GeneOn 20 rcs x 50 µl 164 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)

105-542 GeneOn 100 rcs x 50 µl 549 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)

105-544 GeneOn 1000 rcs x 50 µl 4189 EUR

50ML 2-Mercaptoethanol

NAT1070 National Diagnostics 50ML 94 EUR

TubeSpin Bioteactor (50mL)

TS50 Next Advance 180case 65 EUR

CRYOPRESERVATION BAG, 50ML

91-200-88 CORNING 1/pk 81 EUR

 

Odkrycia wskazują, że DirectDetect może być używany do wielu różnych typów próbek przy jednoczesnym zmniejszeniu liczby odczynników i czasu potrzebnego do diagnozy. Chociaż badanie to pokazuje obiecujące wyniki przy użyciu wyników DirectDetect, dalsza walidacja tego testu przy użyciu większego zestawu próbek jest wymagana do oceny rzeczywistej wydajności tego testu.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany. Wymagane pola są oznaczone *