Pandemia z 2019 r. spowodowana nowym koronawirusem (SARS-CoV-2) nadal szybko rozprzestrzenia się na całym świecie. Amplifikacja kwasu nukleinowego służy jako złoty standard metody potwierdzania zakażenia COVID-19. Jednak wyzwania stojące przed laboratoriami diagnostycznymi z krajów nierozwiniętych obejmują brak zestawów i materiałów do oczyszczania wirusowego RNA. Dlatego pilnie należy zweryfikować alternatywne metody izolacji kwasów nukleinowych dla SARS-CoV-2.

Nasze wyniki pokazują, że stężony bufor do amplifikacji lizy wirusa (vLAB) przygotowany z niejonowym detergentem IGEPAL umożliwia jakościowe wykrywanie SARS-CoV-2 przez bezpośrednią reakcję łańcuchową odwrotnej transkryptazy-polimerazy (dRT-PCR). Ponadto vLAB skutecznie inaktywował SARS-CoV-2. Ponieważ metoda ta jest niedroga i nie jest wymagany sprzęt do oczyszczania RNA ani dodatkowa synteza cDNA, to dRT-PCR z vLAB należy rozważyć jako alternatywną metodę jakościowego wykrywania SARS-CoV-2.

Liza komórek, a następnie uwolnienie genomowego DNA to ciągły dylemat technik biologii molekularnej.

W większości przypadków technologie takie jak PCR i inne techniki amplifikacji wymagają etapów ekstrakcji i oczyszczania DNA. Proces inteligentnej amplifikacji w wersji 2 (SmartAmp2) to izotermiczna i zintegrowana technologia amplifikacji, która eliminuje potrzebę czasochłonnego przygotowywania próbek w celu szybkiego wykrywania kwasów nukleinowych, w tym polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP), mutacji i innych celów. Ponadto amplifikacja DNA bezpośrednio z pełnej krwi jest korzystna i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego. Tradycyjne testy SmartAmp2 obejmują dwa etapy i wymagają wstępnej obróbki alkalicznej w temperaturze 98 stopni C przed przebiegiem w temperaturze 60 stopni.

Aby uczynić SmartAmp2 prawdziwie izotermicznym i uprościć amplifikację DNA, niniejszym wprowadzamy SmartAmp Isothermal Lysis Buffer (SIL-B), nowo opracowany chaotropowy bufor do lizy, który umożliwia jednoczesne odzyskiwanie i denaturację materiału genomowego bezpośrednio z pełnej krwi w jednolitych 60 stopniach C. Udoskonalona metoda izolowania kwasów nukleinowych z krwi pełnej jest kamieniem milowym w tworzeniu prawdziwie izotermicznego wzmacniacza SmartAmp2 od początku do końca w jednej temperaturze, zwiększając jego potencjał do rutynowego stosowania w terenowych testach przyłóżkowych. Ponadto wstępne traktowanie SIL-B umożliwia amplifikację PCR materiału genomowego bezpośrednio z pełnej krwi.

Wykrywanie wirusów na jagodach jest trudnym zadaniem, często utrudnionym przez obecność substancji hamujących RT-qPCR z soku z jagód.

Wcześniej opublikowano metodę bezpośredniej ekstrakcji do wykrywania wirusów (mysiego norowirusa i faga GA) z mrożonych malin. Rozbudowaliśmy (różne rodzaje jagód i wirusów) i ulepszyliśmy metodę za pomocą kolumn MobiSpin S400, które filtrują kwasy nukleinowe w oparciu o chromatografię wykluczenia. Chociaż w przefiltrowanym RNA nie wykryto hamowania, niefiltrowany RNA wymagał rozcieńczenia od 1:2 do ponad 1:8 w celu usunięcia hamowania. Zmodyfikowana metoda dała odzyskanie norowirusa bydła około 40,8 ± 4,5% (40,0 ± 7,0%), 48,0 ± 26,0% (50,5 ± 7,8%), 28,3 ± 2,6% (45,8 ± 6,6%) z mrożonych (świeżych) malin, truskawek i odpowiednio jagody. W przypadku tych samych próbek odzyski wirusa zapalenia wątroby typu A wynosiły 34,0 ± 5,9% (34,0 ± 6,0%), 40,0 ± 13,3% (34,2 ± 10,5%) i 23,0 ± 6,8% (31,5 ± 7,9%).

W przypadku adenowirusa 40 (wirus DNA) odzyski wynosiły odpowiednio 21,2 ± 8,6%, 16,0 ± 3,2% i 5,7 ± 0,2% ze świeżych malin, truskawek i jagód, a filtracja kolumnowa nie przyniosła żadnego polepszenia efektu. Zmodyfikowana metoda jest skuteczna i oszczędza czas w wykrywaniu wirusowego RNA zarówno ze świeżych, jak i mrożonych jagód. Jako nowa metoda wykrywania i bezpośredniej oceny ilościowej, cyfrowy RT-PCR kropelkowy został porównany z RT-qPCR i był znacznie mniejszy pod wpływem inhibitorów podczas wykrywania mengowirusa w niefiltrowanym RNA z jagód. Jednak w przypadku niskich poziomów czystego RNA RT-qPCR wykazał nieco wyższą czułość i bardziej stabilne wyniki.

Celem tego badania było bezpośrednie wykrycie koronawirusa kotów metodą PCR w czasie rzeczywistym oraz trzema różnymi szybkimi testami immunochromatograficznymi (RIM) wykrywającymi antygeny w próbkach kału kotów ze schronisk.

Na podstawie czułości i swoistości obliczonych dla każdego z testów RIM porównano użyteczność testów RIM. Zbadano siedemdziesiąt próbek kału pochodzących od kotów ze schroniska poddanych kwarantannie. Spośród 70 próbek analizowanych metodą PCR w czasie rzeczywistym 44 (62,9%) było pozytywnych. Znacząco więcej kotów ( p  < 0,05) uzyskało wynik pozytywny niż negatywny. Ani wiek, ani płeć kotów nie odgrywały istotnej roli ( p  > 0,05) w stanie wydalania wirusa.

Stwierdzono, że czułość testów RIM jest niska (<35%; testy RIM A i C) do poziomu zadowalającego (>50%, test RIM B). Liczba cząstek wirusa określona na podstawie analizy RT-PCR w czasie rzeczywistym nie korelowała istotnie z wynikami wykrytymi w żadnym z testów RIM ( p  > 0,05). Wyniki tego badania wskazują, że zastosowanie szybkich testów antygenowych RIM w rutynowych badaniach przesiewowych statusu wydalania FCoV u kotów ze schroniska jest ograniczone ze względu na występowanie dużej liczby wyników fałszywie ujemnych.

COVID-19 to choroba zakaźna, która spowodowała globalną pandemię dotykającą ludzi na całym świecie. Ponieważ wykrywanie chorób i wprowadzanie szczepionek postępują, nadal istnieje zapotrzebowanie na skuteczne narzędzia diagnostyczne, aby zaspokoić potrzeby w zakresie ciągłych testów. W tym wstępnym badaniu oceniono nowy test diagnostyczny SARS-CoV-2 o nazwie DirectDetect SARS-CoV-2 Bezpośrednia reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkryptazą w czasie rzeczywistym (RT-PCR) w oparciu o ograniczoną wielkość próbki 24 próbek oddechowych z 14 SARS-CoV- Pacjenci 2-pozytywni. Test jest korzystniejszy w porównaniu z innymi testami dostępnymi na rynku, ponieważ nie wymaga pożywki transportowej wirusa ani ekstrakcji wirusowego RNA przed amplifikacją i detekcją kwasu nukleinowego.

Ta zdolność przekształca wielogodzinny czas przygotowania próbki w procedurę trwającą kilka minut, jednocześnie eliminując potrzebę stosowania wielu kosztownych odczynników, które mogą być trudne do uzyskania podczas gwałtownego wzrostu liczby testów opartych na kwasach nukleinowych podczas pandemii. Wyniki wskazują na pozytywną zgodność 94,7, 100 i 94,7% między suchymi wymazami z próbkami, próbkami poddanymi działaniu i próbkami niepoddanymi działaniu testowanymi przy użyciu DirectDetect SARS-CoV-2 Direct Real-time RT-PCR w porównaniu z testami stosowanymi w laboratorium klinicznym, odpowiednio.

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL)
101-T Cusabio 50 ml 169.2 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (TAIL)
102-T Viagen 100ml 248.4 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR)
401-E Viagen 25 ml 169.2 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (EAR)
402-E Viagen 50 ml 248.4 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL)
301-C Viagen 50 ml 169.2 EUR

DIRECTPCR LYSIS REAGENT (CELL)
302-C Viagen 100 ml 248.4 EUR

Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer
ABP-PP-MT01100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Mouse Tail Direct Lysis Buffer
ABP-PP-MT01500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

amfiSure Direct PCR Lysis Buffer
D0300-010 GenDepot 100ml 165.6 EUR

Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit
ABP-PP-MT02100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Mouse Tail Direct PCR Kit
ABP-PP-MT02500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free
X3100-010 GenDepot 100ml 208.8 EUR

Xpro IP Cell Lysis Reagent,SDS Free
X3100-050 GenDepot 500ml 380.4 EUR

Alkphos Direct Labelling Reagents
RPN3680 Scientific Laboratory Supplies EACH 813.6 EUR

DIRECTPCR LYSIS YOLK SAC 100ML
202-Y Viagen 100 ml 248.4 EUR

Reagent Reservoir 50ml
F267670 Scientific Laboratory Supplies PK100 262.8 EUR

Bottle Pyrex Reagent 50ml.
1516/02D Scientific Laboratory Supplies PK10 106.8 EUR

TARGATT? H11 Mouse Tail Lysis PCR Kit
AST-2005 Applied StemCell 100 reactions 156.72 EUR

TARGATT? Rosa26 Mouse Tail Lysis PCR Kit
AST-2006 Applied StemCell 100 reactions 156.72 EUR

Bottle Reagent Simax 50ml
BOT53020 Scientific Laboratory Supplies PK10 66 EUR

Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer
ABP-PP-BD01100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Human Blood Direct Lysis Buffer
ABP-PP-BD01500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

DetectX® Creatinine Reagent, 50ML
C004-50ML Arbor Assays 50ML 360 EUR

DIRECTPCR LYSIS RGNT(YOLK SAC)
201-Y Viagen 50 ml 169.2 EUR

Select Reagent Bottle Wide Mouth Clear 50ml
BOT64420 Scientific Laboratory Supplies PK10 61.2 EUR

Simax Reagent Bottle Narrow Mouth Amber 50ml
BOT64222 Scientific Laboratory Supplies PK10 61.2 EUR

Costar 50mL Reagent Reservoirs 5/Bag Sterile
4870 Scientific Laboratory Supplies PK200 298.8 EUR

Costar 50mL Reagent Reservoirs 1/Bag Sterile
4871 Scientific Laboratory Supplies PK100 346.8 EUR

Plant Direct PCR Kit
PD105-01 Vazyme 50 rxn (50 μl/rxn) 202.8 EUR

Plant Direct PCR Kit
PD105-02 Vazyme 200 rxn (50 μl/rxn) 424.8 EUR

Direct PCR Complete Kit
S700 GeneOn 100 rcs 159.6 EUR

Direct PCR Complete Kit
S700-2 GeneOn 5x100 rcs 628.8 EUR

FastAmp Plant Direct PCR Kit - 1250 Reactions
4615 Intact Genomics 1/EA 621.6 EUR

Blood Direct PCR Kit V2
PD103-01 Vazyme 50 rxn 202.8 EUR

Blood Direct PCR Kit V2
PD103-02 Vazyme 200 rxn 424.8 EUR

BCA Reagent, 16ML
C144-16ML Arbor Assays 16ML 132 EUR

TDA Reagent - 10mL
MIC6732 Scientific Laboratory Supplies EACH 26.33 EUR

PYR Reagent - 10mL
MIC6744 Scientific Laboratory Supplies EACH 31.12 EUR

Reagent Bottle Clear Narrow neck with plastic stopper 50ml
BOT2140 Scientific Laboratory Supplies PK10 40.2 EUR

Reagent Bottle Amber Narrow neck with plastic stopper 50ml
BOT2156 Scientific Laboratory Supplies PK10 46.92 EUR

Color Reagent A, 15ML
X094-15ML Arbor Assays 15ML 59 EUR

Color Reagent A, 38ML
X094-38ML Arbor Assays 38ML 120 EUR

Color Reagent B, 15ML
X095-15ML Arbor Assays 15ML 59 EUR

Color Reagent B, 38ML
X095-38ML Arbor Assays 38ML 120 EUR

Dissociation Reagent, 25ML
X017-25ML Arbor Assays 25ML 242 EUR

Bottle Reagent 500ml Pyrex
B54564 Scientific Laboratory Supplies PK10 124.8 EUR

Nitrate Reagent A - 10mL
MIC6720 Scientific Laboratory Supplies EACH 26.33 EUR

Nitrate Reagent B- 10mL
MIC6722 Scientific Laboratory Supplies EACH 26.33 EUR

Indole Kovacs Reagent - 10mL
MIC6734 Scientific Laboratory Supplies EACH 26.33 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)
B40013 Bimake 200 ractions 250.8 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)
B40015 Bimake 500 ractions 490.8 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)
B45012 Bimake 1ml*5 (500 ractions) 336 EUR

Mouse Direct PCR Kit (For Genotyping)
B45013 Bimake 1ml*20 (2000 ractions) 1038 EUR

MIDASplus 10mL Single Reagent 100mL
M-MDSR-106 MiTeGen 100 ml ml 183 EUR

Creatinine Color Reagent, 28ML
C004-28ML Arbor Assays 28ML 254 EUR

cAMP Biotrak(TM) EIA; (Non-Acetylation Protocol; Lysis Reagents not Included); Cytiva; RPN2251
GERPN2251 Scientific Laboratory Supplies EACH 685.2 EUR

Hemoglobin Detection Reagent, 20ML
C038-20ML Arbor Assays 20ML 242 EUR

Bottle Reagent Pyrex 100ml.
B54558 Scientific Laboratory Supplies PK10 90 EUR

Simax Reagent Bottle 100ml
BOT53040 Scientific Laboratory Supplies PK10 28.8 EUR

Simax Reagent Bottle 250ml
BOT53060 Scientific Laboratory Supplies PK10 33.6 EUR

Simax Reagent Bottle 500ml
BOT5308 Scientific Laboratory Supplies EACH 4.19 EUR

Simax Reagent Bottle 500ml
BOT53080 Scientific Laboratory Supplies PK10 39.6 EUR

Reagent Bottle Amber 100ml
BOT64240 Scientific Laboratory Supplies PK10 98.4 EUR

Reagent Bottle Amber 250ml
BOT64260 Scientific Laboratory Supplies PK10 82.8 EUR

Reagent Bottle Amber 500ml
BOT64282 Scientific Laboratory Supplies PK10 126 EUR

Reagent Bottles Amber 500ml
BOT53080A Scientific Laboratory Supplies PK10 357.6 EUR

Voges-Proskauer I Reagent 10mL
MIC6726 Scientific Laboratory Supplies EACH 26.33 EUR

Voges-Proskauer II Reagent 10mL
MIC6728 Scientific Laboratory Supplies EACH 26.33 EUR

Reagent Reservoir 25ml NS
F267660 Scientific Laboratory Supplies PK100 159.6 EUR

DetectX® Creatinine Reagent, 20ML
C004-20ML Arbor Assays 20ML 254 EUR

MIDASplus HT-96 Single Reagent 100mL
M-MDSR-107 MiTeGen 100 ml ml 183 EUR

Bottle Reagent Amber Wn 250ml
BOT64660 Scientific Laboratory Supplies PK10 114 EUR

EP Reagent Biuret Reagent
1011601 Scientific Laboratory Supplies 1L 52.8 EUR

Reagent Bottle Wide Clear 100ml
BOT64440 Scientific Laboratory Supplies PK10 62.4 EUR

Reagent Bottle Wide Clear 250ml
BOT64460 Scientific Laboratory Supplies PK10 81.6 EUR

Simax Reagent Bottle Amber 1000ml
BOT53100A Scientific Laboratory Supplies PK10 483.6 EUR

Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit
ABP-PP-BD02100 Allele Biotech 100 RXNS Ask for price

Allele-In-One Human Blood Direct PCR Kit
ABP-PP-BD02500 Allele Biotech 500 RXNS Ask for price

Pyrex Reagent Bottle 500ml Square
1520/08D Scientific Laboratory Supplies PK10 133.2 EUR

EP Reagent Iodoplatinate Reagent
1046300 Scientific Laboratory Supplies 200ML 446.4 EUR

The BCS Screen HT-96 Single Reagent 100mL
M-MDSR-105 MiTeGen 100 ml ml 155 EUR

EP Reagent Molybdovanadic Reagent
1056700 Scientific Laboratory Supplies 100ML 52.8 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)
105-540 GeneOn 20 rcs x 50 µl 196.8 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)
105-542 GeneOn 100 rcs x 50 µl 658.8 EUR

One.Direct.Step RT-qPCR Kit for Probes (DIRECT PCR FROM BLOOD)
105-544 GeneOn 1000 rcs x 50 µl 5026.8 EUR

Corning 3D Clear Tissue Clearing Reagent - 100mL
5733 Scientific Laboratory Supplies EACH 1309.2 EUR

The BCS Screen 10 mL kit Single Reagent 100mL
M-MDSR-104 MiTeGen 100 ml ml 155 EUR

EP Reagent Methoxyphenylacetic Reagent
1053601 Scientific Laboratory Supplies 100ML 435.6 EUR

The BCS Eco Screen HT-96 Single Reagent 100mL
M-MDSR-105-ECO MiTeGen 100 ml ml 155 EUR

EP Reagent Sulfomolybdic Reagent R3
1086500 Scientific Laboratory Supplies 1L 354 EUR

EP Reagent Phosphomolybdotungstic Reagent
1065000 Scientific Laboratory Supplies 100ML 201.6 EUR

EP Reagent 0.05M Iodine
R3002700 Scientific Laboratory Supplies 1L 78 EUR

EP Reagent 0.01M Iodine
R3002900 Scientific Laboratory Supplies 1L 150 EUR

Corning 3D Clear Tissue Clearing Reagent - 10mL
5731 Scientific Laboratory Supplies EACH 196.8 EUR

Corning 3D Clear Tissue Clearing Reagent - 30mL
5732 Scientific Laboratory Supplies EACH 481.2 EUR

The BCS Eco Screen 10 mL kit Single Reagent 100mL
M-MDSR-104-ECO MiTeGen 100 ml ml 155 EUR

DeStreak reagent 1mL
17600318 Scientific Laboratory Supplies EACH 82.8 EUR

Hach Total Chlorine Reagent For 25ml
1406499 Scientific Laboratory Supplies PK100 55.2 EUR

FRAP Reagent A, 1.4ML
C148-1.4ML Arbor Assays 1.4ML 150 EUR

FRAP Reagent B, 1.4ML
C149-1.4ML Arbor Assays 1.4ML 150 EUR

 

Odkrycia wskazują, że DirectDetect może być używany do wielu różnych typów próbek przy jednoczesnym zmniejszeniu liczby odczynników i czasu potrzebnego do diagnozy. Chociaż badanie to pokazuje obiecujące wyniki przy użyciu wyników DirectDetect, dalsza walidacja tego testu przy użyciu większego zestawu próbek jest wymagana do oceny rzeczywistej wydajności tego testu.

amplification and omissionamplification attackamplification cascade pictureamplification curveamplification curve mutation meaningamplification definitionamplification definition literatureamplification effectamplification examplesamplification factoramplification of dnaamplification plotamplification rateamplification rhetorical deviceamplification synonymamplification technologiesamplification translationamplification翻译
By Blog, clusterin antibodyLeave a Comment on Bezpośrednia amplifikacja SARS-CoV-2 metodą RT-PCR z próbek klinicznych przy użyciu stężonego buforu do lizy-amplifikacji wirusa przygotowanego z użyciem IGEPAL-630

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany. Wymagane pola są oznaczone *