Homeofarm – Bulk Biotech Lab Suppliers

Cel Przygotowanie uniwersalnych przeciwciał drugorzędowych, które mogą wiązać się z IgG myszy i królików oraz wykorzystywać przeciwciała w różnych testach immunologicznych. Metody Geny fuzyjne gronkowcowego białka A (SPA), paciorkowca białka G (SPG) i peroksydazy chrzanowej (HRP) zsyntetyzowano i sklonowano do wektora pcDNATM 3.1 w celu wytworzenia eukariotycznych plazmidów ekspresyjnych. Plazmidy przejściowo transfekowano do komórek HEK293F w celu ekspresji.

Białko fuzyjne eksprymowane w plazmidzie wykrywano metodą SDS-PAGE i Western blotting, a jego immunoaktywność mierzono metodą Western blotting, ELISA i barwieniem immunohistochemicznym. Wyniki Trawienie enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonowanie genów wykazały, że udało się stworzyć plazmidy pPA-HRP, pPG-HRP i pPA/G-HRP. Barwienie brylantowym błękitem Coomassie i Western blot wykazały, że białka fuzyjne PA-HRP, PG-HRP i PA/G-HRP z powodzeniem ulegały ekspresji w komórkach HEK293F. Western blot, ELISA i barwienie immunohistochemiczne wykazały, że IgG pochodzące od myszy i królików mogą być rozpoznawane i wiązane przez trzy rodzaje białek fuzyjnych, z których białko fuzyjne PA/G-HRP wykazywało najwyższe powinowactwo.

Zwierzęta transgeniczne zawierające geny ludzkich przeciwciał są niezwykle atrakcyjne dla opracowywania leków, ponieważ omijają późniejsze procedury humanizacji przeciwciał wymagane do terapeutycznej translacji.

• Platformy transgeniczne zostały stworzone wcześniej przy użyciu myszy, ale ostatnio także szczurów, kurczaków i krów, i są obecnie powszechnie wykorzystywane do opracowywania leków. Jednak generowanie przeciwciał na bazie królików, z dużymi osiągnięciami w zakresie swoistości i powinowactwa, jest w stanie obejmować dywersyfikację sekwencji za pośrednictwem konwersji genów, tym samym wzmacniając dojrzewanie wiązania i poprawiając wariancję/selekcję przeciwciał wyjściowych w inny sposób niż u gryzoni.
• Ponieważ dodatkowo często umożliwia dobre generowanie dobrego wiązania przeciwko antygenom, które są tylko słabo immunogenne w innych organizmach, jest bardzo interesującym gatunkiem do wytwarzania przeciwciał terapeutycznych. Opisujemy tutaj wytwarzanie, wykorzystanie i analizę pierwszego transgenicznego szczepu królika do produkcji ludzkich przeciwciał.
• Poprzez nokaut endogennych genów IgM i wprowadzenie sekwencji ludzkiej immunoglobuliny, ten szczep królika został tak skonstruowany, aby generować bardzo zróżnicowany repertuar ludzkich przeciwciał IgG. Ponadto wprowadziliśmy ludzkie geny CD79a/b i Bcl2 (chłoniak z komórek B 2), które zwiększają ekspresję receptora komórek B i przeżycie komórek B.
• Po immunizacji przeciwko angiogennemu czynnikowi BMP9 (białka morfogenetyczne kości 9), byliśmy w stanie wyizolować z tych królików zestaw znakomicie powinowatych i swoistych przeciwciał neutralizujących. Analiza sekwencji tych środków wiążących wykazała, że ​​zarówno hipermutacja somatyczna, jak i konwersja genów są w pełni funkcjonalne w tym szczepie, bez uszczerbku dla bardzo wysokiego stopnia człowieczeństwa. Ta potężna nowa strategia transgeniczna pozwoli na dalszą ekspansję wykorzystania endogennych mechanizmów odpornościowych w opracowywaniu leków.

Zapalenie płuc wywołane przez Staphylococcus aureus wiąże się z wysoką śmiertelnością, niezależnie od wrażliwości na antybiotyki.

Zarówno szczepy MRSA, jak i MSSA wytwarzają silne cytotoksyny: alfa-hemolizynę (Hla) i do pięciu leukocydyn – LukSF-PV, HlgAB, HlgCB, LukED i LukGH (LukAB) – w celu uniknięcia wrodzonych mechanizmów obronnych gospodarza. Wykazano, że neutralizujące cytotoksyny zapewniają korzyści w zakresie przeżycia w modelach królików z zapaleniem płuc wywołanym przez S. aureus. Zbadaliśmy mechanizmy ochrony ASN100, kombinacji dwóch ludzkich przeciwciał monoklonalnych (mAb), ASN-1 i ASN-2, które razem neutralizują Hla i pięć leukocydyn, w modelach zapalenia płuc królika MRSA i MSSA.

Po profilaktycznej immunizacji biernej ASN100 wykazywał zależny od dawki wzrost przeżycia i był w pełni ochronny przed wszystkimi testowanymi szczepami S. aureus przy dawkach 5 lub 20 mg/kg. Makroskopową i mikroskopową patologię płuc, szybkość obrzęków i obciążenie bakteriami oceniono 12 godzin po zakażeniu i zmniejszono za pomocą ASN100. Analiza farmakokinetyczna ASN100 w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego od niezakażonych zwierząt wykazała skuteczną penetrację płynu wyściółkowego nabłonka płuc, osiągając szczytowe poziomy między 24 a 48 godzinami po podaniu, które były porównywalne ze stężeniem mAb zmierzonym w surowicy. Dane te potwierdzają, że mAb ASN100 neutralizują silne cytotoksyny S. aureus w płucach i zapobiegają uszkodzeniu bariery śluzówkowej i wrodzonych komórek odpornościowych.

Autorzy opisują preparatykę złocisto-platynowych nanokwiatów (AuPt NFs) i wykazują, że mogą one być jednocześnie stosowane jako znacznik i jako enzym naśladujący w testach immunologicznych z przepływem bocznym (LFI).

AuPt NF zostały przygotowane przez hodowanie nanodrutów Pt na powierzchni nanocząstek złota. Test obejmuje wychwytywanie białek docelowych (tutaj: króliczej IgG jako analitu modelowego) przez unieruchomione przeciwciało wychwytujące oraz przy użyciu przeciwciała drugorzędowego znakowanego AuPt NF. W ten sposób AuPt NF są wychwytywane przez strefę testową i wytwarzają charakterystyczny czarny pasek do wizualnego wykrywania antygenu (IgG). Zabarwienie linii testowej można dodatkowo wzmocnić przez dodanie substratu chromogennego3-amino-9-etylokarbazol, który jest katalitycznie utleniany przez wychwycone nanodruty Pt na AuPt NF i wytwarza czerwone zabarwienie. Wyniki ilościowe uzyskano poprzez odczytanie natężeń linii testowych za pomocą przenośnego czytnika pasków. LFI ma granicę wykrywalności 5 pg mL-1 dla IgG w zoptymalizowanych warunkach eksperymentalnych. To 100 razy mniej niż w przypadku konwencjonalnego LFI opartego na AuNP.

Niewykluczone, że test ten ma szeroki zakres, ponieważ może być stosowany do wielu innych celów, dla których dostępne są odpowiednie przeciwciała. Graficzne streszczenie Nanokwiaty złota i platyny są używane jako etykieta i jako naśladujący enzym w wysoce czułym teście immunologicznym z przepływem bocznym na IgG. Granica wykrywalności testu przepływu bocznego opartego na nanokwiatkach złota i platyny jest 100 razy niższa niż w przypadku konwencjonalnego testu przepływu bocznego opartego na nanocząsteczkach złota.

Der p 5 jest jednym z ważnych alergenów roztoczy kurzu domowego w Algierii; ten alergen jest często rozpoznawany przez pacjentów z astmą alergiczną. Jednak nie ma informacji na temat jego epitopów wiążących IgG. W niniejszym badaniu króliki immunizowano rekombinowanym alergenem Der p 5 i pobrano próbki surowicy. Rozpoznawanie liniowych epitopów IgG Der p 5 określono przy użyciu zsyntetyzowanych peptydów pochodzących z sekwencji alergenu.

Wyniki wykazały, że surowica z immunizowanych królików rozpoznawała trzy liniowe epitopy z Der p 5 ( ^{28 EDKKHDYQNEFDFLLMERIHEQIK43} ) , ( ^{37IHEQIKKGELALFYLQEQ55} ) i ^{( 92LMQRKDLDIFEQYNLEMAKKS112} ) ^. Co ciekawsze, zaobserwowaliśmy, że  sekwencja aminokwasowa ⁹² L-S ¹¹²  jest dobrze rozpoznawana zarówno przez przeciwciała IgE, jak i IgG. Der p 5 stymuluje syntezę specyficznych przeciwciał IgG, które rozpoznają wspólne, ale także nowe epitopy w porównaniu z wiązaniem przeciwciał IgE. Rzeczywiście, potencjał do indukowania przeciwciał IgG można wykorzystać do hamowania wiązania ludzkiej IgE z alergenami, co może być częścią mechanizmu działania swoistej immunoterapii.